Zwiększenie czułości testów reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym na SARS

Biorąc pod uwagę niedawne obawy dotyczące nawrotu ciężkiego zespołu ostrej niewydolności oddechowej (SARS) w Guangdong, w Chinach, chcielibyśmy podkreślić ogromne znaczenie czułości w testowaniu koronawirusa związanego z SARS (SARS-CoV). Ponieważ początkowe objawy SARS są podobne do innych częstych chorób układu oddechowego, ustalenie konkretnej diagnozy SARS stanowi problem dla personelu medycznego. Nasza rozszerzona metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym (ERT) (pierwsza zaprezentowana w czerwcu 2003 r. Na sympozjum poświęconym SARS1) została zaprojektowana do wykrywania SARS-CoV z wysoką czułością i łatwymi do interpretacji wynikami. 2 Siła techniki ERT została obecnie szeroko zbadana dzięki opracowaniu testów diagnostycznych opartych na ERT dla różnych chorób zakaźnych, w tym ptasiej grypy i pryszczycy.
Rysunek 1. Ryc. 1. Wyniki zmodyfikowanej reakcji łańcuchowej polimerazy o zmodyfikowanym czasie rzeczywistym (ERT) (PCR) z jednoetapową reakcją PCR z odwrotną transkryptazą (RT-PCR). Czułość techniki ERT jest dziesięciokrotnie większa niż w przypadku zwykłej PCR w czasie rzeczywistym. Sporządzono seryjne rozcieńczenia (10-2 do 10-4) znanej ilości kwasu nukleinowego SARS-CoV (jak wcześniej opisano1) i zastosowano do porównania czułości techniki ERT z jednoetapową RT-PCR (Panel A) lub oddzielne etapy RT i PCR (Panel B), a następnie PCR w czasie rzeczywistym (TaqMan) w identycznych warunkach. Zmiana znormalizowanych sygnałów reporterowych (.Rn) jest obliczana przez normalizowanie sygnałów reporterowych sygnałami fluorescencyjnymi podawanymi przez pasywne odniesienie. W tym przypadku wykryto region genu błona-białko SARS-CoV. Pozytywne sygnały są wyraźnie wyświetlane jako wyraźne krzywe amplifikacji na obydwu wykresach PCR w czasie rzeczywistym, podczas gdy ujemne sygnały pozostają jednoznacznie płaskie wzdłuż odciętych. Wyniki wyraźnie pokazują, że jednoetapowa RT-PCR zwiększa czułość techniki ERT o współczynnik 10 w porównaniu ze zwykłą techniką ERT.
Od czasu pierwszego raportu dotyczącego wyników ERT dla SARS, 2 technika ERT została zmodyfikowana w celu zwiększenia jej czułości wykrywania SARS-CoV co najmniej 10 razy (rysunek 1). Ta poprawiona czułość została osiągnięta poprzez połączenie kroków odwrotnej transkryptazy (RT) i PCR w jeden etap (opisany w Dodatkowym Dodatku 1, dostępnym wraz z pełnym tekstem tego listu na stronie www.nejm.org). Ponadto zmiana proceduralna sprawia, że procedura diagnostyczna jest wygodniejsza. Te istotne cechy jednokrokowej reakcji RT-PCR zostały dotychczas pominięte przez innych badaczy w tej dziedzinie. Ponieważ pojedynczy etap RT-PCR i następujący po nim etap PCR w czasie rzeczywistym wymagają tylko 35 cykli, wykrycie SARS-CoV za pomocą zmodyfikowanej techniki ERT daje wyniki szybko iz większą czułością niż zwykłe testy PCR w czasie rzeczywistym, zgłoszone do tej pory.
Jak zauważyła Światowa Organizacja Zdrowia w odniesieniu do niedociągnięć powszechnie spotykanych w dostępnych testach diagnostycznych SARS, 3 ważne jest zunifikowanie testu molekularnego na SARS, który może dostarczyć czułych, wiarygodnych i dokładnych wyników. Obecnie wiele grup badawczych twierdzi, że ich metody są dokładne, ale sposób, w jaki oceniają dokładność, nie jest dokładnie opisany.4 Przydatność dokładnego testu, który nie jest wrażliwy, nie została jeszcze ustalona. O ile nie jest dostępny jednolity test molekularny dla SARS o wysokiej czułości i niezawodności, możemy spotkać się z ryzykiem fałszywie ujemnych wyników testu, które pozwoliłoby zainfekowanym pacjentom na wślizgnięcie się do społeczności i unikanie środków kontrolnych skonfigurowanych do izolowania nosicieli.
Ponad rok po wybuchu epidemii SARS w 2003 r. Wiele osób wciąż boryka się z wyleczonymi w tym czasie bliznami fizjologicznymi i psychicznymi. Identyfikacja potencjalnych nosicieli SARS-CoV metodą o wysokiej czułości i wiarygodności, tak wcześnie, jak to możliwe, ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia powtórzenia się epidemii w 2003 roku.
Albert Cheung-Hoi Yu, Ph.D.
Uniwersytet Pekiński, Pekin 100083, Chiny
[email protected] com.hk
Lok-Ting Lau, Ph.D.
Yin-Wan Wendy Fung, Ph.D.
Hong Kong DNA chipy, Hongkong, Chiny
4 Referencje1. Lau LT, Wang CG, Yu CH. Zwiększone wykrywanie koronawirusa związanego z ciężkim zespołem ostrej niewydolności oddechowej (SARS). Przedstawione na sympozjum wysokiego szczebla ASEAN, Chiny, Japonia i ROK (10 + 3) na temat SARS, Pekin, Chiny, 3-4 czerwca 2003 r. Streszczenie.
Google Scholar
2. Lau LT, Fung YW, Wong FP, i in. Real-time PCR dla koronawirusa SARS zawierającego wstępną amplifikację genu docelowego. Biochem Biophys Res Commun 2003; 312: 1290-1296
Crossref Web of Science MedlineGoogle Scholar
3. Aktualizacja 3: Ogłoszenie podejrzenia o SARS w południowych Chinach: dochodzenie w sprawie źródła zakażenia dla potwierdzonej sprawy rozpoczyna się jutro: 8 stycznia 2004 r. Genewa: Światowa Organizacja Zdrowia, 2004. (Dostęp do 19 marca 2004 r., Na stronie http: // www. .who.int / csr / don / 2004_01_08 / en / print.html.)
Google Scholar
4. Grant PR, Garson JA, Tedder RS, Chan PKS, Tam JS, Sung JJY. Wykrywanie koronawirusa SARS w osoczu za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym. N Engl J Med 2003; 349: 2468-2469
Full Text Web of Science MedlineGoogle Scholar
Materiał uzupełniający
(7)
[hasła pokrewne: wdrożenia magento, bromazepam, Leukocyturia ]
[więcej w: nefropatia toczniowa, ablacja endometrium, pasma śluzu w moczu ]