Mutacje genów ABCA3 u noworodków z niedoborem krytycznego surfaktanta cd

Wyniki analizowano przy użyciu oprogramowania SeqMan (DNAStar) i Mutation Explorer (SoftGenetics). Warianty zidentyfikowano przez porównanie każdej sekwencji z referencyjną sekwencją ABCA3. 18 Rodzicielski DNA sekwencjonowano, gdy próbki były dostępne, a niesynonimowe mutacje analizowano na co najmniej 100 rasowo lub etnicznie dobranych osobnikach (200 chromosomów). Żadna z niesynonimowych mutacji została znaleziona w publicznej bazie danych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) lub w bazie danych Celera, która składa się z sekwencji z dwóch Europejscy Amerykanie, jeden Afroamerykanin, jeden Meksykanin i jeden chiński. Analiza filogenetyczna
Aby przeanalizować ewolucyjną (filogenetyczną) zależność między ABCA3 i pokrewnymi białkami z różnych organizmów, wykorzystaliśmy wyprowadzoną sekwencję aminokwasów ABCA3 (numer dostępu w GenBank NP_001080) do przeszukiwania bazy danych sekwencji przy użyciu programu BLAST (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov / blast /). Podobne białka zidentyfikowano również u innych gatunków kręgowców, jak również bezkręgowców. Sekwencje aminokwasowe zostały wyrównane przy użyciu programu Clustal X.9 Dopasowanie zastosowano do analiz filogenetycznych z udziałem programu Mega2 (http://www.megasoftware.net/).20 Ta metoda generuje dendrogram (lub drzewo) wskazujące stopień, w jakim sekwencje są ewolucyjnie powiązane. Aby przetestować niezawodność drzewa, zaimplementowano test bootstrap z 1000 replikacji w programie Mega2. W tym teście tę samą liczbę aminokwasów, co w oryginalnym zestawie danych losowo pobiera się z zestawu sekwencji i analizuje. Wskazano procent razy, gdy każda gałąź drzewa ma taką samą topologię, co oryginalny zestaw sekwencji. Wartość bootstrap wynosząca 95 procent lub więcej dostarcza mocnych dowodów na ewolucyjną relację między poszczególnymi gałęziami drzewa i oryginalnym zestawem sekwencji.
Analiza ultrastrukturalna
Tkanka do mikroskopii elektronowej została utrwalona w utrwalaczu Karnowskiego (2% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu), utrwalona 1-procentowym tetratlenkiem osmu, zabarwiona en bloc zimnym 4-procentowym octanem uranu w celu zachowania lamelarnego ciała fosfolipidy i wbudowane w EM12 812 (Usługi mikroskopii elektronowej) jak opisano wcześniej.21 Plastyczne sekcje o grubości .m zabarwiono 1% błękitem toluidyny (w 1% boranie sodu w wodzie) i oceniono za pomocą szerokiego pola mikroskop (Nikon FXA-Microphot). Plastikowe sekcje o grubości 0,1 .m wycinano z tych samych bloków, co semitinowe, barwiono octanem uranu i cytrynianem ołowiu i fotografowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (Jeol 1230, Jeol).
Wyniki
Sekwencjonowanie DNA ABCA3
Ryc. 1. Ryc. 1. Rodowody pacjentów z niedoborem surfaktantów. Stałe symbole oznaczają pacjentów. Haplotyp polimorfizmów ABCA3 przedstawiono poniżej każdego dziecka (symbole trójkątne) w rodowodzie. W rodzinie 6 dwoje rodzeństwa nie zgadza się z haplotypami ABCA3, wykluczając ten gen jako przyczynę zaburzenia. Wszystkie inne rodziny mają co najmniej jedną mutację zidentyfikowaną w genie
[hasła pokrewne: ceftriakson, cilostazol, bifidobacterium ]
[przypisy: klykciny konczyste zdjecia, dyżury aptek olkusz, dyżury aptek zawiercie ]